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问:细胞凋亡中磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)


发布日期:2014-05-25
答:

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。


碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1、悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反应5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2、贴壁培养的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3、爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。



外翻分析第二步

外翻分析第二步


注意事项

1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。



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